Docteur en Physique

Cryopréservation d'organes par vitrification

Les techniques actuellement utilisées dans les hôpitaux ne permettent de conserver les organes que durant 4 à 72 h, entre le prélèvement et la greffe (4-6h : coeur, 12 h : pancréas, foie, 48-72h : rein).

La conservation longue durée des organes à basses températures est un des paramètres qui pourront permettre le développement des greffes. Cette recherche nécessite une approche pluridisciplinaire, étant donné la variété des problèmes rencontrés. C'est le cas à Grenoble où une collaboration entre différentes équipes de biologistes, chirurgiens et physiciens essaye de proposer une solution au problème de conservation des organes.

La cryopréservation nécessite de perfuser le greffon avec un cryoprotecteur (antigel) qui va gêner la cristallisation de l'eau contenue dans l'organe. De plus, la technique vers laquelle nous nous sommes tournés pour réaliser cette cryopréservation consiste à vitrifier totalement l'organe. L'état vitreux peut être considéré comme stable par rapport aux temps de conservation souhaités (de quelques semaines à quelques mois). Cela impose de le refroidir très rapidement jusqu'à une température voisine de celle de l'azote liquide (-196°C), à laquelle il sera conservé, puis de le réchauffer également très vite pour éviter toute recristallisation.

J'ai effectué des études physiques nécessaires pour préparer une future expérience de cryopréservation d'un rein de lapin.

Ces études sont brièvement présentées dans ce qui suit :

Calorimétrie différentielle à balayage

• Des études par calorimétrie sur les solutions cryoprotectrices permettent de déterminer les vitesses de refroidissement et de réchauffement à partir desquelles l'eau ne cristallise plus.

• Des études complémentaires effectuées sur des morceaux de reins de lapins ayant été préalablement perfusés avec une solution cryoprotectrice montrent l'influence de l'organe. La cristallisation est plus difficile lorsque la solution est perfusée dans un rein de lapin (et donc confinée par le système vasculaire très fin et divisé) que lorsqu'elle est libre.

Le calorimètre différentielle à balayage DSC-2 de Perkin-Elmer

Toxicité des solutions cryoprotectrices sur les globules rouges

• On peut diminuer la toxicité des solutions cryoprotectrices sur les globules rouges si on leur ajoute quelques pourcents de sucre. Ce phénomène a été observé lors d'une étude du taux d'hémolyse en fonction de la durée de conservation à 4°C.

• Lorsque l'on fait subir un véritable cycle de cryopréservation aux globules rouges on observe également une diminution de la toxicité des solutions mais uniquement sous certaines conditions expérimentales.

• Il est donc envisageable d'abaisser la toxicité pour les organes des solutions cryoprotectrices et ainsi de pouvoir les perfuser avec une quantité suffisante de cryoprotecteur pour réussir à les vitrifier.

L'appareil de congélation (jusqu'à -196°C), le SYPCA de Cryo-Diffusion

Suivi de la diffusion d'un cryoprotecteur dans un rein de lapin par R.M.N.

• Avant d'envisager cryopréserver un organe entier, il faut vérifier l'homogénéïté de l'imprégnation de celui-ci en cryoprotecteur, et connaître le temps de perfusion nécessaire pour atteindre à l'intérieur de l'organe la concentration souhaitée. Dans ce but, j'ai conçu un dispositif expérimental qui permet de refroidir jusqu'aux environs de -10°C un rein de lapin dans un aimant de R.M.N., tout en le perfusant et en effectuant les acquisitions d'images.
  

• Une analyse plus approfondie des images spectroscopiques permet d'estimer la concentration et la température localement, dans le rein. Il est ainsi possible d'ajuster le temps de perfusion afin de limiter la durée du contact avec le cryoprotecteur.

• L'organe n'étant pas dégradé par cette expérience, il peut éventuellement être regreffé par la suite, servir pour une expérience de calorimétrie ou être examiné en anatomopathologie.

Mesures de la viscosité des solutions cryoprotectrices

• La viscosité des solutions cryoprotectrices est un facteur essentiel dans le processus de vitrification, mais également un handicape pour parvenir à imprégner de façon homogène l'organe que l'on perfuse. C'est pourquoi j'ai mesuré, à l'aide d'un viscosimètre à capillaire, l'évolution de cette grandeur en fonction de la concentration de la solution en cryoprotecteur et de la température.

Les conclusions de ce travail

• La compréhension de l'influence exacte de l'organe sur la solution cryoprotectrice, lors du refroidissement et du réchauffement, est importante. En particulier, vérifier si cette influence est essentiellement due au confinement ou si d'autres paramètres interviennent.

• Des études de toxicité complémentaires sont nécessaires pour adapter une solution à chaque organe.

• En effectuant suffisamment d'expériences de R.M.N. on pourra optimiser le protocole de perfusion du rein et tracer la courbe de la concentration en cryoprotecteur dans l'organe au cours de la perfusion et en fonction de la température.

• La vitrification du rein de lapin est expérimentalement réalisable !

• Sa cryopréservation n'est pas une utopie.